案例分享

• 候选酶筛选(高通量表达)

  T7 RNA聚合酶筛选 (高通量)

  客户需求：交付一步纯化的突变体

  

  客户要求	样品数量	交付周期	表达规模	质控检测
  交付一步纯化的突变体	76个	22个工作日	50 mL	A280	SDS-PAGE	完整分子量 (随机挑选5个)

  76个RNA聚合酶表达数据统计

  

  
• 候选酶筛选(小规模表达)

  T7 RNA聚合酶筛选 (1L表达规模)

  客户需求：90%纯度, 交付量5mg, 去除核酸&核酸酶

  

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• 细胞库构建

  用于基因编辑的X酶

  项目目的：交付该基因编辑X酶的工作细胞库

  

  备注：选择表达量突出的克隆构建MCB和WCB

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  1. 表达量评估 & 限制性酶切图谱

  

  结果：通过质粒表达水平评估和限制性检查确认MCB和WCB

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  2. 噬菌体检测

  利用 (DLA) 技术对主细胞库和工作细胞库的噬菌体进行检测

  

  结果：主细胞库和工作细胞库中没有噬菌体污染。

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  3. 质粒稳定性测试

  抗生素加压WCB细胞传代培养 (P20)

  

  结果：工作细胞库的表达水平保持稳定，P1、P5、P10、P15 和 P20 代的SDS-PAGE结果没有显著降低。

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  无抗生素加压WCB细胞传代培养 (P20)

  

  结果：工作细胞库（P1、P5和P10）传代中无明显质粒丢失。

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  4. 长期细胞库活力测试

  测试工作细胞库的活力和表达水平以确定细胞库储存时间。

  检测项	存储时间检查点 (月)
  	0	3	6	12	18	24
  细胞活力	通过	通过	进行中	进行中	进行中	进行中
  表达水平	通过	通过	进行中	进行中	进行中	进行中

• 上游/下游工艺开发

  用于基因编辑的X酶

  项目目的：对该基因编辑酶的细胞培养和纯化工艺进行优化

  

  阶段	项目	批次 1
  上游工艺开发 (细胞培养)	细胞密度 (OD 600)	102
  	湿菌重量	234 g/L
  	培养时间	22 h
  下游工艺开发 (纯化)	外观	澄清, 无色, 液体
  	浓度	12.45 mg/ml
  	纯度 (SDS-PAGE)	>90%
  	纯度 (RP-HPLC)	>95%
  	纯度 (SEC-HPLC)	>95%
  	内毒素	1.7 EU/mg
  	宿主细胞残留 (HCP)	35.49 ng/mL
  	宿主DNA残留 (HCD)	0.06 ng/mL
  	Residual DNAse
  	支原体检测	阴性
  	产量	29.2 mg/L

  用于体外诊断的X酶

  项目目的：对该体外诊断酶的细胞培养和纯化工艺进行优化

  

  阶段	项目	批次 1
  上游工艺开发 (细胞培养)	细胞密度 (OD 600)	162
  	湿菌重量	250 g/L
  	培养时间	22 h
  下游工艺开发 (纯化)	外观	黄色粉末
  	浓度	50 mg/ml
  	纯度 (SDS-PAGE)	>95%
  	纯度 (SEC-HPLC)	>99%
  	水分	4.0 %
  	活性	> 40 KU/g
  	产量	> 4.5 g/L

• 分析方法开发
  

  SDS-PAGE

  

  SEC/RP-HPLC

  

  E.coli 宿主DNA残留检测

  qPCR assay kit

  

  支原体DNA检测

  qPCR assay kit

  

  内毒素检测

  Endotoxin LAL test

  

  E.coli 宿主细胞残留检测

  ELISA assay kit

  

  脱氧核糖核酸酶残留检测

  DNaseAlert™ QC System

  

  核糖核酸酶残留检测

  RNaseAlert™ QC System

  MAD7酶活性方法

  

  	缓冲液1	缓冲液2
  sgRNA1	82.3%	91.3%
  sgRNA2	62.6%	87.9%
  sgRNA3	84.3%	93.3%
  sgRNA4	42.7%	66.8%
  sgRNA5	68.8%	93.0%

  

  sgRNA	酶	10分钟	60分钟
  sgRNA3(30nM)	MAD7(5 nM)	84.3%	90.1%
  sgRNA3(30nM)	MAD7(15 nM)	93.1%	98.2%
  sgRNA3(30nM)	MAD7(30 nM)	97.9%	98.4%

• 制剂缓冲液开发

  MAD7存储缓冲液筛选

  简称	编号	缓冲液组成	来源
  P	Buffer 1	50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5, 50 % (v/v)  glycerol and 1 mM TCEP	Rojek et al., 2021
  TA	Buffer 2	10 mM Tris (pH 7.4), 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, and 50% (v/v) glycerol.	GenScript
  TB	Buffer 3	10 mM Tris (pH 7.4), 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.1 mM EDTA, and 50% Glycerol	ABM

  

  MAD7的冻融检测

  	起始材料	-80°C 轻度冻融 (10次)	LN2快速冻融 (10次)
  外观	透明液体	透明液体	透明液体
  HPLC 纯度	>99%	>99%	>99%
  A280 浓度 (mg/ml)	11.40	11.55	10.76
  SDS-PAGE 纯度	90%	90%	90%

• 稳定性检测

  MAD7压力稳定性检测

  	0 天	5 天	10 天	30 天
  外观 (15°C)	澄清	澄清	澄清	澄清
  纯度 (15°C)	99%	99%	99%	99%
  外观 (37°C)	澄清	发白	发白	发白
  纯度 (37°C)	99%	91%	85%	71%

  MAD7加速稳定性检测

  	0 月	3 月	6 月
  外观 (5°C)	澄清	进行中	进行中
  纯度 (5°C)	99%	进行中	进行中
  外观 (25°C)	澄清	进行中	进行中
  纯度 (25°C)	99%	进行中	进行中

  MAD7长期稳定性检测

  	0 月	1 月	2 月	3 月	6 月	9 月	12 月	18 月	24 月
  外观	澄清	澄清	澄清	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中
  A280 浓度 (mg/ml)	11.40	11.36	11.11	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中
  HPLC 纯度	>99%	>99%	>99%	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中	进行中

FAQs

问：定制化酶的开发和交付的常规交付周期是多久？

答：交付周期会因项目的复杂性和具体要求而有所不同，黄金城集团将由专业技术团队进行评估以确定具体的交付时间。然而，黄金城集团一直致力于提供高效和及时的解决方案，通常情况下，黄金城集团能够在数月内完成并交付您所需的定制酶产品。

问：机器学习在酶开发过程中扮演什么角色？

答：黄金城集团采用杰出的机器学习和深度学习技术来分析各类酶工程项目期间产生的大量数据集合，识别模型，并预测酶的行为。黄金城集团可以更高效地设计具有改进性能的酶，更好的满足您的定制需求。

问：在进行酶开发项目的合作时，GenScript如何处理知识产权和保密问题？

答：黄金城集团高度重视知识产权和保密事项。黄金城集团的合作协议中包含了保护您的权益和确保敏感信息保密的条款。黄金城集团一直秉承严格的道德标准，致力于在合作中维护良好的伦理行为。

问：定制酶的生产规模是多少，如何确保不同生产规模的一致性？

答：黄金城集团可以根据您的具体需求扩大生产规模，无论是研究级别还是大型工业级别。黄金城集团拥有严格的质量控制流程，以确保在不同规模下的酶生产一致性。

问：GenScript如何及时了解酶开发和生物技术的最新进展？

答：黄金城集团拥有专门的研发团队，不断跟踪该领域的最新动态。此外，黄金城集团与领先的专家和学术机构合作，以确保黄金城集团始终站在酶开发和生物技术创新的前沿。

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