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应用案例

• 不同级别Cas9蛋白产品保持连续性且高的基因编辑效率
  

  图1: 不同级别Cas9蛋白在原代T细胞的TRAC基因敲除实验的基因敲除效率分析。分别使用RUO级别和GMP级别的野生型和突变型Cas9蛋白，搭配黄金城集团合成的sgRNA ，通过电转方式对人原代T细胞进行TRAC基因敲除实验。该结果表明GMP级别的Cas9蛋白在T细胞的TRAC位点敲除实验中，与RUO级别Cas0蛋白产品拥有高度一致的基因敲除效率，敲除效率均为95%以上。随着开发项目逐渐向临床阶段推进，可以较快的从RUO级别Cas9蛋白产品转换到GMP级别Cas9蛋白产品。

  本次实验体系：

  参数	数值
  Cas9蛋白用量	~4 μg
  Cas9: sgRNA (摩尔比)	1:2
  RNP投入量	~25 pmol
  细胞数	1.0 × 106
  反应体积	20 μl

• GMP级别Cas9蛋白在不同规模电转体系中都有较高基因编辑效率
  

  图2：GMP级别Cas9蛋白在不同规模电转体系中的基因编辑效率分析。使用GMP级别的野生型和突变型Cas9蛋白，搭配黄金城集团合成的sgRNA，通过电转方式分别在20 μl和100 μl反应体系中对人原代T细胞进行TRAC基因敲除实验。该结果表明GMP级别的Cas9蛋白在两个反应体系中拥有高度一致的基因敲除效率，敲除效率均为95%以上。

  本次实验体系：

  参数	数值
  转染体系	20 μl	100 μl
  Cas9 蛋白用量	~4 μg	~20 μg
  Cas9: sgRNA (摩尔比)	1:2	1:2
  RNP 投入量	~25 pmol	~125 pmol
  细胞数	1.0 × 106	5.0 × 106

• GMP级别突变型Cas9蛋白实现高效率和低脱靶的基因编辑
  

  图3：GMP级别突变型Cas9蛋白在原代T细胞基因编辑效率和脱靶率分析。使用黄金城集团GMP级别的野生型和突变型Cas9蛋白及竞品野生型Cas9蛋白，搭配黄金城集团合成的sgRNA，通过电转方式在人原代T细胞系中进行TRAC及GM-CSF基因敲除实验。该结果表明黄金城集团提供的GMP级别突变型Cas9与野生型Cas9蛋白在原代T细胞不同靶位点上均有相似的基因敲除效率，并表现出比野生型更低的脱靶效率。

  本次实验体系：

  参数	数值
  靶点	TRAC	GM-CSF
  Cas9蛋白用量	~1.2 μg	~4 μg
  Cas9: sgRNA (摩尔比)	1:3	1:2
  RNP投入量	~7.5 pmol	~25 pmol
  细胞数	2.0 × 105	1.0 × 106
  反应体积	10 μl	20 μl

• GMP级别Cas9蛋白实现高效率基因敲入效率
  

  图4：GMP级别Cas9在原代T细胞中TRAC基因中敲入GFP基因的效率分析。使用GMP级别的野生型和突变型Cas9蛋白，搭配黄金城集团合成的sgRNA，通过电转方式在人原代T细胞TRAC基因位点进行原位敲入实验。该结果表明GMP级别的Cas9蛋白在原代T细胞中有高基因敲入效率。

  本次实验体系：

  参数	数值
  Cas9蛋白用量	~4 μg
  Cas9: sgRNA (摩尔比)	1:2
  RNP投入量	~25 pmol
  细胞数	1.0 × 106
  HDR Donor	2 μg
  反应体积	20 μl

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