蛋白表达

• 客户为什么要选择黄金城集团生产定制蛋白表达？

  黄金城集团提供的与众不同的蛋白质服务具有以下特点：

  （a）黄金城集团有经验丰富的科学家来服务于您的定制要求 - 黄金城集团已经成功交付>10,000批次定制蛋白，>5,000批次定制抗体。（b）高成功率 - 黄金城集团的大肠杆菌表达系统成功率高达95％；其他表达系统的成功率也远高于行业平均水平。（c）高容量 - 高达2,000L的细菌/酵母蛋白大规模发酵，高达100L的昆虫以及200L哺乳动物蛋白大规模发酵。（d）黄金城集团具有成熟且先进的技术平台。

• 黄金城集团在定制蛋白服务方面经验如何？

  2003年，黄金城集团开始提供定制蛋白表达服务。黄金城集团拥有15+年的蛋白表达经验，拥有在国外大型生物医药公司工作25年经验的蛋白表达专家，建立了强大的技术团队，可以帮您选择更为优质的实验方案，助力您的研发进程。截止2019年底，黄金城集团已为客户成功生产并交付超过15,000批次定制蛋白。

• 黄金城集团提供哪些蛋白表达系统？

  黄金城集团能提供大肠杆菌表达系统，昆虫细胞表达系统和哺乳动物表达系统的定制蛋白服务。

• 如何选择合适的蛋白表达系统？各个表达系统的优缺点？

  这取决于客户蛋白的来源（细菌、动物或其它）和纯化蛋白的用途。如果不需要对蛋白进行翻译后修饰，黄金城集团推荐低成本、高成功率的大肠杆菌表达系统；反之，黄金城集团将根据客户的预算和具体的要求推荐昆虫细胞，或哺乳动物细胞表达系统。请垂询黄金城集团的专业客服代表，竭诚为客户推荐合适的表达系统。

  系统	优点	缺点
  E.coli	成本低，表达高，周期短	无翻译后修饰； 可能形成包涵体，纯化后影响活性
  Insect	蛋白存在翻译后修饰，糖基化类型与天然蛋白稍有不同。 适合表达激酶或病毒蛋白，大分子量蛋白。	成本稍高 周期较原核长
  Mammalian	蛋白翻译后修饰非常接近天然蛋白。 非常适合重组抗体的表达(表达量高)	成本高

• 黄金城集团蛋白表达平台的能力？

  细菌表达系统：（a）提供大量的高达克级的蛋白产品（b）提供10 - 2,000L范围内的细菌发酵服务（c）提供纯度超过98%的均质重组蛋白。 杆状病毒昆虫细胞表达系统：（a）提供携带目的基因（一个或者多个）的高滴度重组杆状病毒储液，滴度高达10^9pfu/ ml（b）提供纯度超过98％的均质重组蛋白（c）提供多达数百毫克的蛋白产品（或100L培养液）。 哺乳动物细胞表达系统：（a）提供纯度超过98％的均质重组蛋白（b）提供毫克至克级的蛋白产品（或200升培养液）。

• 密码子优化真的重要么？基因部门与蛋白部门的密码子优化有什么区别吗？密码子优化是否促进解决表达可溶性蛋白？

  密码子优化能大幅度提高蛋白的表达水平，黄金城集团由于OptimumGene™密码子优化技术。数千实例已证明黄金城集团密码子优化的有效性。

  目前蛋白部与基因部密码子优化使用的是同一套系统，密码子优化仅能促进蛋白表达量提高，无法促进可溶。

• 对于不同的表达系统，从1L中试培养物中通常能得到多少蛋白？

  不同的表达系统蛋白表达水平不同，以下是3种表达系统的蛋白表达平均水平：
  a. 细菌表达系统平均1-5mg/L，高达3g/L；
  b. 昆虫表达系统平均1-3mg/L，部分蛋白可以达到35mg/L以上；
  c. 哺乳动物表达系统平均1-40mg/L(常规重组蛋白)和50-100mg/L（抗体），根据不同抗体种属和具体序列会有些许不同。高达3g/L。

• 为什么黄金城集团建议在放大前进行1L中试蛋白表达？

  通过优化1L中试规模下的蛋白表达条件，黄金城集团可以准确地评估您的定制蛋白的培养体系和纯化条件，以便为您节省时间和预算。

• 蛋白的分子量（MW）对蛋白生产有影响吗？

  黄金城集团的蛋白服务能表达分子量10-250KD的蛋白（大肠杆菌系统：150KD；其它系统：250KD）。生产更大分子量的蛋白会越来越困难，因为分子量过大的蛋白在表达时极易降解或者表达困难。

• 为什么黄金城集团需要询问表达蛋白的天然形式是否为一种膜蛋白，细胞质蛋白，酶或蛋白酶或IgG抗体？

  与细胞内蛋白不同，大部分膜蛋白原核表达困难，真核表达较好，但纯化涉及到多种表面活性剂筛选，往往纯化较困难。对于酶或者蛋白酶，需要保持蛋白活性，所以纯化一般在低温下进行，并且会添加保护剂。

• 对于抗体制备，对抗原蛋白是否有特殊要求？

  抗原（蛋白）需要溶于PBS或者其他的不含有机溶剂的缓冲液中。抗原蛋白一般更偏向带小标签（如6xHis，HA，FLAG，V5，c-myc）。对于单克隆抗体的制备，要求蛋白抗原含量应大于2mg，纯度大于75％。用于诊断型或功能型单克隆抗体的开发的抗原，需要更高的纯度，一般需要85％-90％的纯度；对于多克隆抗体的制备，蛋白抗原含量应大于4mg，纯度大于85％（如需获得纯化的多克隆抗体，则请另外提供5mg抗原蛋白）。浓度一般要求>0.4mg/ml。

• 大肠杆菌表达系统获得蛋白的浓度通常能达到多少？如果客户需要纯化的蛋白纯度达到xx mg/ml，是否可以做到？

  获得蛋白的浓度通常在0.1 - 3 mg/ml之间（保证大于0.1mg/ml）。黄金城集团可以根据客户的要求浓缩蛋白（大多数情况下不额外收取费用），如果浓缩过程中发现蛋白在高浓度下不稳定会及时与您沟通储存在合适的浓度中，避免蛋白大量损失。

• 如果蛋白在大肠杆菌系统中不能成功表达或者纯化怎么办？成功率有多高？

  黄金城集团专家建议通过以下方法来解决这个问题：（1）如果没有进行过密码子优化，建议进行密码子优化（2）去除跨膜区和信号肽区域（3）尽量表达蛋白的截短域（4）尝试不同的标签，以增加蛋白表达水平（5）尝试不同的表达系统（比如昆虫细胞表达系统可用于表达某些特定蛋白）。
  如果蛋白不表达或纯化后未得到蛋白，黄金城集团将根据实验步骤收取费用。对于所有的套餐，黄金城集团都会交付蛋白表达评估报告。黄金城集团目前已表达上万个蛋白，原核表达成功率在95%以上。

• 黄金城集团能否对酵母和昆虫系统表达的蛋白进行复性？

  大多数情况下，昆虫表达系统表达的蛋白是可溶的，所以黄金城集团一般不对昆虫系统表达的蛋白进行复性。特殊情况下，蛋白可溶较差，真核表达系统中蛋白也出现了不可溶的现象，如果您不介意蛋白复性，黄金城集团可以进一步尝试复性蛋白。

• 如果客户提供杆状病毒，黄金城集团需要多少病毒来生产蛋白？

  如客户提供杆状病毒，还请提供以下信息：杆状病毒滴度和病毒储液代数，感染所需的MOI，细胞密度和细胞体积。黄金城集团将使用相关公式来计算需添加多少病毒储液，以获得所需要的接种量（ml）。MOI指每个细胞所含的病毒颗粒数目。 通常，P1和P2代病毒储液是较佳选择，病毒储液滴度应大于10 ^ 7 pfu/ ml。 同时，如果您提供的病毒量不足，黄金城集团还提供病毒扩增的服务。

• 什么是"晶体学级"蛋白？

  用于结晶的蛋白质应该是均匀的并且纯度大于90％。结晶前需通过HPLC或者MS检测蛋白纯度是否达标。 DLS（动态光散射）检测结果对纯度鉴定有所帮助，但不是必需的。结晶需要的蛋白最低量是10μg*300μl。

• 客户想表达一个由两个亚基构成的异源二聚体，黄金城集团有何建议，是构建一个重组载体还是分别构建两个重组载体？

  具体的实验策略应根据实际情况而定，对于某些蛋白两种方案都可行。黄金城集团在这两种情况下都有成功的纪录。

• 客户是用蛋白自身的信号肽，还是黄金城集团的人工信号肽？

  原核：一般去除信号肽表达，如需要分泌表达，建议用原核表达载体常用的pelB，MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA，比如PET22b载体；

  昆虫细胞：替代目的基因信号肽：gp67信号肽：MLLVNQSHQG FNKEHTSKMV SAIVLYVLLA AAAHSAFA

  哺乳动物细胞：信号肽默认用GenScript default signal peptide。

• 克隆方案中His标签放在N端还是C端好？

  如果您表达的蛋白大小适中，且后续不需要切除标签，N端或者C端都可以；如果您表达的蛋白较小，建议放在C端，可以缓解蛋白降解；如果您后续需要酶切标签，建议放在N端，可以避免氨基酸残留。

• 蛋白表达可以承接的最小蛋白是多少个氨基酸？蛋白服务和长链多肽服务如何界定？目前黄金城集团是否可承接毒性蛋白生产业务？

  最小承接过的蛋白为70aa，<50aa一般做多肽合成，>50aa多肽合成困难可以尝试表达。对于对人体有害的有毒蛋白表达不做承接，其他毒性蛋白根据情况分析后确定是否可以承接。

• 如果客户有一个蛋白需要在哺乳动物表达系统中进行表达，但是这个蛋白是胞内蛋白，黄金城集团有什么建议？

  哺乳动物系统不接受胞内蛋白表达需求，可以尝试用其他表达系统，比如ecoli和insect系统。

• 客户提供质粒的话，需要同时提供质粒的哪些信息，提供的质粒需要做检测吗？

  质粒的载体，目的序列，插入位点。最好提供包含目的基因的全载体序列。如果您对质粒的信息非常清楚，可以不做检测。如果并不很清楚，且表达出现问题，建议先安排测序。

• 黄金城集团在构建表达嵌合抗体时是否总是加入Kozak序列？为什么使用Kozak序列？

  是的，黄金城集团在所有嵌合结构中使用Kozak序列。Kozak共识序列（例如GCCACCatgG）在真核mRNA的翻译过程中起到作用，对于提高蛋白表达也是必须的。

• 如果客户提供可变区，需要黄金城集团提供恒定区，黄金城集团的建议是什么？用人和鼠的在表达量和活性上有什么不同吗？在哺乳动物定制表达载体中已构建的11种恒定区有哪些？哪些是GenScript向客户推荐的？为什么这些比其他好？

  黄金城集团可以提供通用的恒定区序列，做小鼠和人类嵌合载体。嵌合抗体在结合抗原方面的活性没有变化，但因为Fc不同生物活性会有不同，人抗和鼠抗的表达水平不同，甚至同一种属的不同亚类也会不同。黄金城集团在pcDNA3.4中构建了10种恒定区，10个恒定区是hIgG1, hIgG4, hIgkappa, hIglamda, mIgG1, mIgG2a, mIgG2b, Rabbit IgG, Rabbit Kappa和mIgkappa。黄金城集团通常分别使用hIgG1 / kappa和mIgG2a / kappa作为人和小鼠嵌合抗体，因为这部分恒定区的表达量较高。

• 如果客户想要同时表达两个基因，黄金城集团是否建议与两个载体共转染，或者更喜欢将两个基因放在一个载体中？哪一种方法对成功交付更有信心？

  两种方法都有优点和缺点（用两种载体共转染或在一种载体中插入两种基因）。最好了解更多细节/或与客户讨论具体项目目的后，来确定哪种方法是更好的选择。

• 黄金城集团最常用的转染方法是什么？与其它方法（比如常规脂质体）相比，使用高分子聚合物PEI的优势是什么？

  黄金城集团使用聚乙烯亚胺（PEI）作为瞬时表达的转染试剂。因为与其他方法相比，它具有低成本、易于使用和相对高转染效率的优势。 Lipofectamine转染效率通常很高。然而，其高成本限制了其用于小规模和大规模瞬时表达。

• 如果瞬时表达的表达水平较低，通常如何调整或优化实验方案以提高表达水平？

  通常蛋白表达情况主要由蛋白由自身性质决定，常用的优化措施如下：密码子优化、转染方式优化（特别是对一些转染效率低的细胞系）、优化细胞培养方案、测试细胞裂解液分析蛋白质是分泌表达情况、改变宿主细胞系：293-6E、CHO-3E7、HD 293F、HD CHO-s，改变信号肽、改变表达载体、克隆策略（比如Fc标签策略，位点突变）、纯化步骤的缓冲筛选（沉淀，溶解度）、加蛋白酶抑制剂（如果有蛋白降解现象）。

• 什么会影响基因合成和表达的成本？

  基因合成成本主要取决于基因的长度和复杂性。表达（蛋白质生产）成本主要受以下因素影响：1）您选择的表达系统（大肠杆菌，昆虫或哺乳动物），2）您需要的蛋白质量和纯度，以及3）其他特殊要求（例如标签去除，内毒素水平控制，特殊标签等）。

• 客户可以提供Bacmid做蛋白表达吗？

  我司通常建议客户可以提供pFast Bac plasmid，因为提供pFast Bac plasmid和Bacmid对生产时间和价格影响不大，且Bacmid不易保存。当然，如果客户能确保Bacmid在运输过程中无杂菌污染，我司也能接受。

• 是否接受客户提供高质量的质粒直接进行哺乳动物细胞转染表达？

  我司不建议使用客户提供质粒转染细胞进行蛋白表达，因为哺乳动物细胞比较敏感，如果质粒在运输过程中被污染，可能会严重影响蛋白表达情况。而且，黄金城集团可以从基因合成开始（不需要客户提供模板），提供高品质的质粒用于细胞转染。

• 进行1L哺乳动物细胞瞬转蛋白表达周期是?

  1L蛋白瞬转表达（包括基因合成）短至6周，1L抗体瞬转表达（包括基因合成）短至5周。

• 能否请公司先做评估，然后再决定是否要订购瞬时表达或稳定的细胞系？

  在做瞬转放大或进行稳定细胞系生成之前，我司会先进行小规模表达评价，并且需要客户决定是否想要做瞬时表达或进行稳定细胞系构建。用于瞬时表达的载体与用于稳定细胞系的载体不同。

蛋白纯化

• 在大肠杆菌蛋白表达系统中，你们是从细胞裂解液的可溶成分还是包涵体中纯化蛋白？你们能否折叠复性包涵体蛋白？复性是否可以达到天然状态？

  黄金城集团可从这两种成分中纯化蛋白，具体哪一种取决于客户的要求，或可行的实验方案，黄金城集团的专家在蛋白质折叠复性方面经验丰富。黄金城集团有包涵体蛋白复性的专业服务，会根据蛋白质的序列及其结构特性选择特定的复性策略。原核表达本身缺乏翻译后修饰，复性可以尽量接近天然状态，但无法保证。

• 蛋白表达过程中，杂质有些什么？如何去除这些杂质？黄金城集团内部有哪些蛋白纯化方法？如何选择使用哪种纯化方法？多步纯化常用纯化流程？

  黄金城集团能提供亲和纯化，离子交换层析，疏水层析和分子筛层析。杂质大多是细胞内或培养基内的物质，可以通过层析技术去除。 一般对于含有亲和标签的蛋白，首选亲和层析后根据得到的蛋白纯度以及杂蛋白的位置性质，相应选择多步纯化的步骤。

• 黄金城集团平台能否提供抗体亲和纯化？

  如果客户提供实验方案，黄金城集团便能提供相关服务。

• 客户希望蛋白不带标签表达，黄金城集团能纯化么？

  黄金城集团可以通过离子交换层析，疏水层析和分子筛层析等方法尝试纯化，如果您后续能接受小标签，比如6*His，建议还是尝试带标签表达，在标签亲和纯化基础上拿到高纯度蛋白会更容易。

• 黄金城集团包涵体纯化是先纯化还是先复性？复性是采用什么方法？客户送包涵体，让黄金城集团复性，能够接单吗？

  黄金城集团一般是先纯化后复性，复性步骤黄金城集团会筛选不同缓冲液进行蛋白复性实验，直到选择到合适缓冲液，使蛋白达到接近天然的状态。不单独承接包涵体复性服务。

• 客户的蛋白容易降解，黄金城集团在纯化时怎么处理？

  在纯化过程中黄金城集团会添加蛋白酶抑制剂，并且纯化手段会采用较温和的方法进行，比如用裂解酶代替超声破碎，并且会在低温下快速操作，在较短时间内纯化到蛋白。如果有必要，黄金城集团会采用多步纯化，以拿到更高纯度的目的蛋白。

• 客户需要蛋白有活性，黄金城集团保证么？黄金城集团会通过哪些方法尽可能获得活性蛋白？

  由于影响蛋白活性的因素有很多，所以，黄金城集团无法保证蛋白的活性，但是黄金城集团会通过蛋白分析给出您在表达和纯化中的建议，尽量获得活性蛋白。

• 抗体纯化你们采用什么纯化方法？

  一般采用Protein A或者Protein G纯化。

• 内毒素是如何控制的？黄金城集团的内毒素水平能做到什么标准？

  蛋白部原核系统去除内毒素有三个水平<1EU/µg（1000EU/mg）、<0.1EU/µg（100EU/mg）、<0.01EU/µg（10EU/mg），1EU/mg较难做到，哺乳动物细胞表达系统做到1EU/mg容易一些，抗体可以做到0.5EU/mg，应用于小鼠的典型控内毒蛋白需求是<3 EU/mg，应用于人的典型控内毒蛋白需求是<1 EU/mg。哺乳动物细胞表达的内控标准是10EU/mg，但黄金城集团不默认检测内毒素含量，如果客户要求最终提供内毒素QC数据，如果客户有内毒素控制需求，需要在实验开始前提出。 通过控制试剂，容器以及表达纯化过程中的内毒素引入来控制内毒素水平。如果内毒素水平仍然较高，可以通过去内毒的柱子或是离子柱进一步去除。

• 蛋白纯度最高可以做到多少？蛋白纯化后对应纯度蛋白应用有哪些？如50%纯度蛋白有哪些实验应用？80%、90%、95%蛋白可应用于哪些实验？

  纯度可以达到95%，Biacore和结晶对纯度要求较高，一般要求高于90%纯度，很难根据纯度界定应用。

• 发酵业务，工艺优化包括哪些方面？

  包含温度，时间，诱导条件，溶氧，补料。

• 黄金城集团常用蛋白复性方法？

  需要根据蛋白质序列和结构特性选择特定的复性策略，比如：1）直接稀释，2）透析和渗滤，3）小分子助剂：变性剂，氨基酸，聚合物：胶束和脂质体，酒精，还原/氧化试剂，盐：NaCl/KCl/MgCl2和(NH4)2SO4，糖：葡萄糖、蔗糖和海藻糖等，4）分子伴侣，5）基质辅助方法：SEC、HIC、亲和柱和IEC，6）梯度方法。

• 离子柱或者Flag标签蛋白纯化费用是多少？

  根据纯化蛋白的量决定，费用比常规His或者GST纯化要贵。

蛋白标签

• 对于蛋白表达和纯化，黄金城集团建议引入什么标签？为什么常推荐客户使用His标签？哪些标签有利于提到蛋白可溶性？

  常用的标签有His, GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO, Flag和Fc等。黄金城集团专家会根据蛋白的性质以及客户的特殊要求推荐不同的标签。单独的His标签或者His与其它标签的混合（比如His-GST）是常用的纯化标签。

  His标签较小，一般对下游应用影响不大。且后期纯化成本低。有利于提高蛋白可溶性的标签有: GST, MBP, Trx, TF, MBP, Nus, SUMO等。

• 黄金城集团能否在蛋白纯化后去除标签？如果可以，费用和周期如何？黄金城集团标签酶切的费用为何比其它公司高出1-2倍？能保证最终的酶切回收结果么？

  黄金城集团能对在标签旁引入了蛋白酶切位点的纯化蛋白进行标签去除。具体价格和周期，请咨询黄金城集团的技术支持。 一般黄金城集团会先进行小试酶切确定放大的可行性、估算回收率，也减少您费用较高拿不到蛋白的风险。

• 在标签和目的蛋白之间，黄金城集团推荐引入什么蛋白酶切位点？

  如果需要去除标签，黄金城集团建议在标签和目的蛋白之间引入肠激酶，凝血酶，TEV蛋白酶，3C蛋白酶（精密蛋白酶）或SUMO蛋白酶切位点。

• 黄金城集团建议在蛋白N端还是C端引入标签和蛋白酶切位点？

  黄金城集团建议在蛋白N端引入蛋白酶切位点和标签，而不是在C端引入，因为C端标签经蛋白酶酶切后会残留4-6个氨基酸。

• 重组蛋白N端标签经什么蛋白酶酶切后不会残留氨基酸？

  重组蛋白N端标签经EK酶和SUMO酶酶切后不会残留任何氨基酸，经TEV酶切后会残留一个甘氨酸"G"或"S"，经3C蛋白酶（精密蛋白酶）酶切后会残留一个甘氨酸"G"和一个脯氨酸"P"。

• 黄金城集团为什么不能直接给出酶切放大的费用？

  黄金城集团在酶切放大前建议先进行酶切小试，摸索最佳酶切比例及酶切条件；如果酶切小试效果较好，黄金城集团可以根据酶切小试的结果以及您后续需要的tag free蛋白量进行评估报价。如果酶切小试效果不好，不建议进行后续的酶切放大。

• 为了提高溶解度，黄金城集团最常使用哪些标签？黄金城集团最常使用什么标签进行纯化？

  通常，黄金城集团在使用哺乳动物表达产生重组蛋白时不会遇到不溶性问题。大多数时候，哺乳动物细胞中产生的蛋白质是完全加工的分泌蛋白质，因此没有不溶性问题。对于困难蛋白质诸如膜蛋白，黄金城集团通常使用含有去污剂的商业试剂来裂解细胞以用于检测和定量目的。常规使用的标签包括His标签、Fc融合标签和Flag标签。

• 黄金城集团通常会建议蛋白添加标签表达的原因？

  黄金城集团有成功表达纯化无标签蛋白的经验，但是，为了提高蛋白的表达、方便后续蛋白的纯化，黄金城集团会在征得客户许可前提下，带标签进行蛋白表达。

• 对于昆虫系统，常用促溶标签有哪些？常用的纯化标签?

  促溶标签有GST。常用的纯化标签有His标签。也可以使用Flag、Fc、GST标签。

• HA标签氨基酸序列是?

  HA标签序列是"YPYDVPDYA"。

• 在哺乳动物系统中，常用的标签和蛋白酶切位点有哪些？

  常用标签有Fc、MON-Fc、His和Flag标签。添加Fc标签以提高表达水平。MON-Fc是改进的Fc，可用于降低Fc融合蛋白的聚集。His和Flag标签是小标签，可以用于亲和纯化。TEV和肠激酶位点是常用的蛋白酶位点。肠溶激酶位点在去除标记物后不会引入氨基酸残留，但其酶特异性不如TEV。

蛋白QC

• 如何确定蛋白的纯度和质量？

  蛋白纯度检测方法：a. SDS-PAGE, b. HPLC, c. 银染法，默认使用SDS-PAGE。

  蛋白浓度检测方法：a. Bradford蛋白测定法; b. BCA蛋白分析法；默认使用bradford, 如果buffer中有影响成分会采用BCA；抗体都是A280检测。

• 黄金城集团会检测蛋白产品的内毒素水平么？

  通常黄金城集团不会检测蛋白产品的内毒素水平，但会根据客户要求，检测并去除蛋白产品的内毒素。此服务需额外收费。其中内毒素控制和去除服务，需要在项目开展前提出，因为控制和去除内毒素的操作是在表达和纯化过程中进行的。

• 蛋白表达服务会交付哪些QC数据？纯化后的蛋白黄金城集团是否要做序列验证？如果不做，如何保证拿到的蛋白是客户的目的蛋白？

  黄金城集团蛋白表达鉴定提供的免费QC数据包括SDS-PAGE和Western blot检测结果（His抗体、GST抗体或者其他抗体）。黄金城集团纯化蛋白提供的免费QC数据只有SDS-PAGE，客户可以订购其它额外收费的QC检测服务，比如Western blot，HPLC，LC-MS和N-Terminal Sequencing。

  纯化后对于大小无异常蛋白不做序列验证。

  如需进一步验证可以订购蛋白覆盖率检测服务。

• 对于杆状病毒制备服务（SC1261），黄金城集团会交付哪些QC数据？

  黄金城集团通过Western blot（His抗体、GST抗体或者其他抗体）检测P1和P2病毒储液蛋白表达情况，通过qRT-PCR检测病毒的滴度。最终的QC文件包含qRT-PCR和Western blot结果。

• 客户表达的蛋白没有标签，黄金城集团采用什么方法QC？

  黄金城集团的QC首先会有SDS-PAGE，如果您能提供蛋白的特异性抗体，黄金城集团可以为您进行WB检测。对于纯化后的tag free蛋白，黄金城集团还可以进行肽段覆盖率检测，以确认纯化到的蛋白是目的蛋白（该项检测可能会额外收费）。

• 黄金城集团在做SDS-PAGE和western时，蛋白上样量是多少？

  这取决于目的蛋白的浓度。一般QC黄金城集团会上样2ug做纯度检测。

• 黄金城集团发货报告中会有详细的实验步骤吗？

  最终的发货报告中不包含详细的实验步骤。如果需要详细步骤，如要额外收取费用。

蛋白运输和保存

• 杆状病毒产品的最适运输条件以及长期保存条件分别是什么？运输缓冲液与长期保存缓冲液是否有差别？病毒液如何保持效价？黄金城集团昆虫细胞表达交付的病毒低度范围？病毒是否可以风干保存？

  杆状病毒运输温度是4℃，保存缓冲液是Sf-900 II SFM和2% FBS。杆状病毒的长期保存条件是-80℃冻存。但是，随着每一次冻融，病毒滴度会降低50%。所以对于常规使用，黄金城集团建议将病毒分装，并在4℃避光保存。杆状病毒在4℃条件下建议保存3个月，最多可保存6个月。

  病毒默认交付>10^8pfu/ml（病毒测定方法：Q-PCR）。不可风干保存。

• 客户想后续订购大规模蛋白产品，但不是现在。黄金城集团能为客户保存表达载体多长时间？

  订单发货后，黄金城集团会免费为客户保存蛋白表达菌株3个月，大肠杆菌，昆虫和表达系统的相关表达载体黄金城集团会免费保存2年以上。但是，如果客户没有要求黄金城集团为他/她保存载体，黄金城集团可能会销毁相关产品并且不负任何责任。

• 黄金城集团运输蛋白的默认缓冲液是什么？如果客户后续要更换为其他缓冲液，要怎么操作？

  Tris-HCl, pH 7.5-9.0或者PBS, pH 7-8，含5-20%甘油、0-600mM NaCl以及少于5mM DTT, 0.5M L-Arg。如果缓冲液中需要用到以下试剂：0.3% SKL和1% SDS，黄金城集团将会与客户联系确认。

  如果您收到蛋白后希望更换缓冲液，可以采用透析的方法置换。建议先做小量透析确定蛋白在您需求的buffer中稳定，再进行放大，以免蛋白全部损失。

• 黄金城集团提供的蛋白产品是以冻干形式还是液体形式发货？

  默认以液体形式发货。根据客户实际需求，黄金城集团可以发货冻干蛋白，但是需要额外收费。

• 通常，黄金城集团建议蛋白在什么条件下保存？

  请将蛋白等量分装，在-80℃或液氮中长期贮存，并且要避免多次冻融。

慢病毒包装问题

• 黄金城集团提供慢病毒包装的过程是怎样的，以及QC检测有哪几项：

  plenti载体构建---plenti质粒与辅助质粒共转293T细胞----上清收集---病毒纯化、浓缩---滴度测定，支原体检测。

  QC检测包括：病毒滴度p24 ELISA 检测，支原体Lonza 180检测。

• 黄金城集团提供慢病毒的包装使用的载体与细胞系是什么，是否可以提供给客户？

  黄金城集团使用慢病毒包装的质粒为plenti系列的质粒，包括单质粒系统与双质粒系统，可以根据客户的需求进行选择，但是有专利限制，目前还不是IPfree状态，因此不能交付plenti系列的质粒,但是可以交付带有客户目的序列的克隆载体（pUC57）。如果客户希望自己提供质粒，由黄金城集团提供病毒包装服务，可以让客户提供载体的全序列，提交给项目经理进行评估。

  	单质粒系统	双质粒系统
  	Cloning vector	Cloning vector	Co-delivered vector
  病毒载体	pLentiCRISPR v2	pLentiGuide-Puro	pLentiCas9-Blast pLentiCas9-EGFP plentiCas9n(D10A)-Blast
  		lenti sgRNA(MS2)_zeo	Lenti dCAS-VP64_Blast Lenti MS2-P65-HSF1_Hygro Lenti dCAS9-VP64 GFP Lenti MS2-P65-HSF1_GFP
  	pX601 (AAV)	pAAV SpCas9 acceptor (PX552)	pAAV-SpCas9 (PX551)
  	只需一步感染细胞 细胞系构建周期短，可用于原代细胞系，iPS等	需要两步感染细胞，先构建稳定表达Cas9的细胞系

• 黄金城集团使用什么方法检测慢病毒的滴度。

  黄金城集团使用P24 ELISA的方法测定慢病毒滴度。p24蛋白是慢病毒外壳中含量最大的标志性蛋白，一个慢病毒颗粒（Lentiviral Particle, LP）中约有2000个p24蛋白分子，通过ELISA方法检测P24蛋白分子含量以确定病毒的滴度。该方法检测病毒滴度的稳定性要高于qRT-PCR。

• 慢病毒保证服务，可以承接的客户目的基因的大小与价格体系。

  慢病毒载体可容纳<4kb的目的基因。
  生产提供的交付结果以及如果包装失败的解决方式：
  Gene Length<1500bp，黄金城集团保证至少107IFU/ml， 低于107IFU/ml则免费重新包装一次，并以最高滴度发货，费用按照实际滴度对应价格收取。若两次都低于107IFU/ml，则不收取包装费。 1500pb≤Gene Length<3000bp，黄金城集团保证至少107IFU/ml ， 低于107IFU/ml则免费重新包装一次，并以最高低度发货，费用按照实际滴度对应价格收取 。若两次都低于107IFU/ml ，则只收取订单价格50% 费用。
  3000 pb≤Gene Length<4000bp，黄金城集团保证至少106IFU/ml ， 低于106IFU/ml则免费重新包装一次，并以最高滴度发货，费用按照实际滴度对应价格收取 。若两次都低于106IFU/ml ，则只收取订单价格50% 费用。