针对目标序列设计的gRNA与Cas9结合，并将Cas9引导到目标序列，目标序列的PAM序列上游3-4个碱基处，Cas9切割产生双链断裂（DSB）。
两种方法可以修复双链断裂：1. 如果不提供修复模板或供体DNA，则会通过易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 进行重新链接，产生插入缺失从而敲除蛋白质。2. 如果提供修复模板或供体DNA，则会通过同源重组(HDR)方式修复双链断裂，以准确敲入目标基因。
针对目标序列设计的gRNA与Cas9结合，并将Cas9引导到目标序列，目标序列的PAM序列上游3-4个碱基处，Cas9切割产生双链断裂（DSB）。
两种方法可以修复双链断裂：1. 如果不提供修复模板或供体DNA，则会通过易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 进行重新链接，产生插入缺失从而敲除蛋白质。2. 如果提供修复模板或供体DNA，则会通过同源重组(HDR)方式修复双链断裂，以准确敲入目标基因。
易转染的细胞系可以选择质粒，转染效率低的细胞系建议选择病毒，期望达到编辑效率更高、毒性更低的效果可以选择RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的递送系统。
All-in-one载体系统有两个主要优点：
双载体中，Cas9和gRNA在不同的载体上独立表达。如果您计划表达多个gRNA以进行多重靶向，双载体会更合适。对于这些应用，Cas9应首先在细胞系中稳定表达，然后可以用不同的gRNA载体转染细胞以构建细胞库。
CRISPR 基因编辑的载体选择应考虑应用和细胞类型。
直接使用Cas9蛋白或RNP的优势有：
化学合成sgRNA主要有以下优势：
使用sgRNA时，无需在使用前对crRNA和tracrRNA双链体进行退火。更重要的是，几项研究表明，当与Cas9共同作用时，长单链sgRNA比crRNA：tracrRNA具有更好的稳定性，从而有更高的编辑效率1, 2。
设计您的gRNA序列包括4个步骤：
通过提供脱靶评分和染色体位置，黄金城集团的gRNA数据库和在线设计工具将消除您在选择gRNA序列时的疑虑，建议使用3个gRNA序列，以确保敲除和实验准确性。
这取决于实验目的和宿主细胞类型。与双链DNA供体相比，单链DNA表现出显著提高编辑效率和特异性，以及减少脱靶整合的优势，尤其是在编辑原代细胞、干细胞和开发转基因动物模型方面。
| 质粒DNA | dsDNA | ssDNA | |
|---|---|---|---|
| 敲入效率 | 中等 | 高 | 高 |
| 脱靶效应 | 中等 | 高 | 低 |
| 细胞毒性 | 高 | 高 | 低 |
| 成本 | 低 | 中等 | 较高 |
在单链DNA的生产过程中，黄金城集团进行了两轮测序，以保证序列的准确性。黄金城集团首先通过测序选择经过序列验证的质粒DNA模板，以确保最终单链DNA产品的纯度和序列准确性。此外，黄金城集团对最终的单链DNA产品使用直接测序来确认单链DNA产品的序列正确性。最终的单链DNA产品仅包含全长、经过序列验证的单链DNA分子。通过使用黄金城集团专有的、正在申请专利的酶合成方法，黄金城集团提供的单链DNA产品不含双链DNA。
影响CRISPR靶向效率和特异性的因素有：
在黄金城集团订购 gRNA质粒，黄金城集团会提供一个经过序列验证的质粒，其中包含gRNA表达和基因组结合所需的所有元素：U6启动子、间隔（目标）序列、gRNA骨架和终止子。黄金城集团保证提供的gRNA克隆序列准确；然而，鉴于构建基因组编辑细胞系以及转染和实验的复杂性，黄金城集团无法保证使用黄金城集团的gRNA进行实验的结果。如果您希望使用CRISPR技术创建经过序列验证的KO或KI细胞系，请参阅GenCRISPR™基因编辑细胞系服务。
降低脱靶效应的方法：
基因编辑的脱靶率检测一般有两种方法：
一般来说主要通过以下方法：
对于点突变，建议使用非对称单链DNA设计。对于大片段基因插入，有报道显示插入基因侧翼长度可从300到1000bp。在大多数情况下，500bp长度的同源臂就可以了。需要注意的是设计需要包含沉默突变的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列发生突变，以避免二次切割。KI供体设计可能很复杂。强烈建议使用软件（例如 snapgene）来查看和编辑序列。您可以阅读以下文章以获取更多设计技巧。
Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.
