PCR克隆及亚克隆FAQ

• Q1：如需做克隆及亚克隆，我需要提供什么模板？如提供PCR产物，该如何处理？

  通常您需提供的模板是含有目的基因的质粒或菌液，且插入片段已经过测序验证。如提供PCR产物，由于PCR产物容易降解，黄金城集团建议您先做TA克隆，将PCR产物装在T载体上，再进行测序验证，以含有目的基因的T载体作为亚克隆模板，这样成功率较高。

• Q2：做亚克隆服务需提供哪些材料和信息？

  需提供以下材料和信息：

  • 目的基因序列，如果该目的基因经过测序，需要您提供测序彩图文件（abi格式）；
  • 含有目的基因的模板质粒或菌液，以及模板质粒的大小、抗性、图谱等相关信息；
  • 目标载体及相关信息：如果目标载体为商业化空白载体，需要提供载体全称；如果目标载体经过改造，需要提供载体全序列；
  • 亚克隆方式：即利用哪两个酶切位点将目的基因亚克隆至目标载体。
• Q3：黄金城集团交付哪些结果？提供给我的数据报告包括哪些内容？

  交付结果包括：

  • 实物发货：4μg冻干质粒DNA（低拷贝1μg冻干质粒DNA），1管穿刺菌；
  • 数据报告：测序结果、测序结果和目的序列的比对文件、QC报告、质粒结构图。如果您需要提供甘油菌，需要在安排订单时注明。
• Q4：哪些类型载体的亚克隆难度比较大？

  载体比较大、低拷贝载体、背景不明确的载体、自杀性载体和抗性特殊的载体，亚克隆难度比较大。例如：pCAMBIA-1301、pBI121、pKSV7、pMG36e（红霉素抗性）和pCYT（氯霉素抗性）等。

• Q5：什么叫甲基化现象？

  甲基化现象是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是存在的化学性修饰碱基，CG二核苷酸是主要的甲基化位点。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达，DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的作用。

• Q6：什么叫移码现象？在设计亚克隆方案时如何避免移码？

  移码现象是由于基因中增加或减少1~2个碱基（改变的碱基数不是3或3的倍数）使该位点后面的DNA序列发生移码，结果导致不能顺利表达出目的蛋白。黄金城集团在设计亚克隆方案时应注意：a.酶切位点的选择，如NcoI（CCATGG），由于其中有一个起始密码子，很容易产生移码，所以，在使用这类酶切位点时应谨慎，应添加移码保护碱基；b.尽量利用载体上已有的序列。